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DNA-Sequenzierung 05:07 min

Textversion des Videos

Transkript DNA-Sequenzierung

Hallo. In diesem Video geht es um die Sequenzierung der DNA. Der Begriff Sequenzierung bezieht sich auf die Bestimmung der Reihenfolge der Nukleobasen, also die Basensequenz in einem DNA-Strang. Der Einfachheit halber nehmen wir hier nur ein kurzes Stück DNA. Zur Sequenzierung wurden unterschiedliche Methoden entwickelt. Ich werde euch die Methode vorstellen, die heute in den meisten modernen Laboren angewendet wird. Für diese Methode der Sequenzierung gibt es mehrere synonyme Bezeichnungen. Sequenzierung nach Sanger Desoxymethode oder Kettenabbruchmethode. Bei dieser Methode wird zuerst der zu sequenzierende DNA-Abschnitt mithilfe der polymerasen Kettenreaktion vervielfältigt. Über die DNA-Polymerase und die polymerase Kettenreaktion habe ich schon in einem anderen Video gesprochen. Bei der PCR zur Sequenzierung der DNA werden nicht beide Einzelstränge des Doppelstrangs, sondern nur ein Strang vervielfältigt und das nicht nur einmal, sondern viele Tausend Male.

In dem Video über die DNA-Polymerase habt ihr gesehen, dass zum Aufbau eines neuen DNA-Strangs Nukleotide notwendig sind. Diese bestehen aus einem Zuckermolekül der Desoxyribose, einem Phosphatsäurerest oder Phosphat und einer von vielen Nukleobasen. Im Reaktionsgemisch für die PCR sind sehr viele Nukleotide enthalten, dadurch sind genug Bausteine für den neuen Aufbau der DNA-Stränge vorhanden. Die DNA-Polymerase kann neue Nukleotide nur an die OH-Gruppe am dritten C-Atom des Zuckermoleküls des vorhergehenden Nukleotids anhängen. Der Trick der Sanger-Methode der Sequenzierung ist nun, dass in den Reaktionsansatz auch Nukleotide gegeben werden, denen die OH-Gruppe fehlt, sogenannte Didesoxynukleotide. Daher auch der Name Desoxymethode. Die Nukleotide werden genau wie die anderen in den neuen Strang eingebaut, allerdings kann dieser dann nicht weiter verlängert werden. Die Kette bricht ab. Deshalb heißt die Methode auch Kettenabbruchmethode.

Für die Sequenzierung verwendet man 4 Ansätze mit jeweils der gleichen Ausgangs-DNA. In jeden Ansatz kommt eine Mischung von normalen Nukleotiden und Didesoxynukleotiden mit jeweils einer bestimmten Nukleobase. Die Didesoxynukleotide sind Didesoxythymidintriphosphate, Didesoxyadenintriphosphate, Didesoxyguanintriphosphate und Didesoxycytosintriphosphate. Bei der PCR werden in vielen Zyklen immer wieder neue Stränge aufgebaut. Wird beim Aufbau des neuen Stranges anstelle eines normalen Nukleotids zufällig ein Didesoxynukleotid eingebaut, bricht die Synthese des neuen Strangs ab. Am Ende gibt es also tausende Stränge unterschiedlicher Länge, vielmehr als der DNA-Strang, den ich sequenzieren will, Basen hat. Die unterschiedlich langen Stränge werden jetzt durch Gelelektrophorese der Größe nach sortiert und sichtbar gemacht. Lange DNA-Stränge wandern langsamer durch das Gel als kurze, das heißt im unteren Bereich des Gels sind die kurzen DNA-Stränge und im oberen die längeren. Da ich weiß welches Didesoxynukleotid in welchem Ansatz ist kann ich jetzt anhand der Länge der Stücke die Sequenz ablesen. Heute verwendet man nur noch einen Reaktionsansatz, in dem man alle vier Didesoxynukleotide gibt. Um sie unterscheiden zu können, werden sie vorher mit Fluoreszenzfarbstoffen in verschiedenen Farben markiert. Disdesoxy-ATP meist in grün, Didesoxy-CTP in blau, Didesoxy-GTP in gelb und Disdesoxy-TTP in rot. Nach der PCR kommt dann die Mischung der unterschiedlich langen DNA-Stränge nicht auf ein Gel, sondern in eine Maschine, den sogenannten Sequenzer. Dort werden die DNA-Stücke auch nach ihrer Größe sortiert und kommen dann an einen Detektor vorbei, der die Farbe misst, mit der sie am Ende markiert sind. So erhält man dann die Abfolge der Basen im DNA-Strang. Mithilfe dieser Methode können nur DNA-Stränge sequenziert werden, die kürzer als tausend Basenpaare sind.

Wenn also ein längeres DNA-Stück oder gar ein ganzes Genom sequenziert werden soll, wird die entsprechende DNA erst in kleine Teile zerlegt, die sich an den Enden überlappen müssen. Durch diese Überlappung können sie später mithilfe der Sequenz zusammengefügt werden. Die Entwicklung dieser Methode durch Frederick Sanger war ein Meilenstein für die Biotechnologie und ermöglichte erst die Sequenzierung des menschlichen Genoms. Außerdem ist sie die Grundlage für die Erforschung der genetischen Information. Das war ein kurzer Überblick über die Kettenabbruchmethode, wenn ihr noch Fragen habt, schreibt einen Kommentar. Tschüss und danke fürs Zuschauen!

26 Kommentare
  1. Hallo Mytom88mytom,
    ab 3:25 schreibt die Tutorin die Basen auch neben die "DNA Banden": ATCAACGTG
    Du hast also die zweite Base vertauscht.
    Zudem musst du beachten, dass bei einer Gelelektrophorese kleine Moleküle nach unten durchwandern. Oben liegen also die längsten DNA Abschnitte. Somit beginnt die Leserichtung der Sequenz unten. Die Reihenfolge wäre dann: GTGCAACTA. Um es absolut korrekt anzugeben müsstet du nun noch eindeutig machen, um welchen der beiden DNA Stränge es sich handelt, 5' zu 3' oder 3' zu 5'. Die Synthese eines neuen DNA-Stranges erfolgt immer vom 5'- zum 3'- Ende. Da es sich bei den DNA Stücken im Gel um Stücke des synthetisierten DNA-Strangs handelt, lautet die eindeutige Sequenz: 5'GTGCAACTA3'. Die Template DNA ist komplementär dazu.
    Du siehst, wie wichtig es ist, die Grundlagen der Genetik zu verstehen, um eine spezielle Methode verstehen zu können. Grundlagen für dieses Video sind: Der Aufbau der DNA, die Methode der PCR und die Methode der Gelektrophorese.
    Wie im Video gesagt, wird heutzutage allerdings ein "Sequenzer" verwendet, um die Sequenz der DNA zu ermitteln (im Video ab 3:29 erklärt).

    Von Tatjana Elbing, vor mehr als einem Jahr
  2. Also würde der DNA-Strang (aus 3:17)ungefähr so aussehen:
    -weitere Basen--Adenin
    -weitere Basen-Guanin
    -weitere Basen-Cytosin
    -weitere Basen-Adenin...

    Von Mytom88mytom, vor mehr als einem Jahr
  3. Hallo Mytom88mytom,
    stell dir vor ich schreibe 3 Buchstaben alle 1 cm versetzt nebeneinander auf ein Stück Papier. Nun teile ich dir mir, welcher Buchstabe sich bei welchem cm befindet: A bei 2 cm; T bei 0 cm; G bei 1 cm. Kennst du nun die Reihenfolge der Buchstaben?
    Der erste Buchstabe steht am Anfang bei 0 cm: T Der Länge nach weiter folgen die Buchstaben G und A. Die Reihenfolge lautet: TGA
    Genauso lässt sich das Ergebnis der DNA Sequenzierung interpretieren.
    So lässt sich anhand der Länge (die Größe der DNA wird nicht in cm, sondern meist in Basenpaaren angegeben) und des Wissens, an welcher Stelle sich welches Didesoxynukleotid befindet, die Abfolge, die sogenannte Sequenz der Basen ablesen.
    Ich hoffe, dass ich dir damit weiterhelfen konnte.
    Bei weiteren Fragen kannst du dich auch gerne an unseren Hausaufgabenchat, Mo-Fr 17-19 Uhr, wenden.
    Beste Grüße aus der Redaktion

    Von Tatjana Elbing, vor mehr als einem Jahr
  4. Ich verstehe irgendwie noch nicht warum man anhand der Länge der Stücke und des Wissens,wo welches Didesoxynucleotid sich befindet,die Sequenz ablesen kann.(3:21)
    Kann mir das jmd genauer erläutern?

    Von Mytom88mytom, vor fast 2 Jahren
  5. Hallo,
    Ich denke, dass du das Prinzip richtig verstanden hast. Deine Erklärung ist für mich sehr gut nachvollziehbar. Und ich finde es super, dass du nochmal nachgefragt hast.

    Solltest du noch weitere Fragen zum Thema Gentechnik haben, kannst du diese auch gerne im Hausaufgaben-Chat stellen.

    Von Karsten S., vor mehr als 2 Jahren
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